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本制品是一种基于离心柱法从动物组织或培养的动物细胞中安全、快速、便捷、稳定、高效、高质量地提取长度大于200nt的RNA的试剂盒。提取获得的大于200个核苷酸的RNA(也常被称为总RNA)可以用于各种常规用途。

本试剂盒提取得到的RNA可用于反转录、RT-PCR、qPCR、Northern、点杂交(Dot Blot)、纯化mRNA、体外翻译、RNase protection assay、cDNA克隆等下游实验；也可用于基因表达芯片分析(microarray)、高通量测序等对RNA质量要求较高的情况。

本试剂盒与Qiagen公司的RNeasy Mini Kit一致，用于纯化200nt以上的RNA，对小于200nt的small RNA即小RNA(如5.8S rRNA、5S rRNA、tRNA、miRNA、piRNA等)被选择性地去除，如果希望抽提得到小于200nt的小RNA，推荐使用柱式动物小RNA提取试剂盒(货号：YTB4005)或柱式动物RNA提取试剂盒(货号：YTB4006)。

本试剂盒适用于新鲜或冻存的动物组织或细胞RNA的抽提，推荐的细胞用量为50～100万(上限可达1000万)，组织用量为15～20mg(上限可达30mg)。对于不同的组织或细胞上限会有所差别，例如小鼠肝脏组织的上限可达30mg，但肌肉组织的上限为20mg。

• 本试剂盒使用安全。本试剂盒通过特殊的柱纯化介质进行RNA分离纯化，能有效避免传统的Trizol法提取时使用的酚、氯仿等有毒有害有机试剂。
  
• 本试剂盒使用快速、便捷。本试剂盒采用柱纯化，无需繁琐的RNA沉淀步骤，提取操作过程仅15～20分钟。相比于传统的Trizol提取法，本试剂盒的操作流程显著简化，缩短了提取时间，降低了RNA被降解的风险。和国外同类柱纯化产品相比，所需操作步骤和操作时间基本一致。
  
• 本试剂盒提取RNA的得率高。本试剂盒的提取效果经反复测试，100万个HeLa细胞能提取得到约15-20μgRNA，20mg小鼠肝组织能提取得到约25-35μgRNA，20mg小鼠脑组织中提取得到约10-20μgRNA(新鲜样品的得率高于冻存样品)。本试剂盒与传统的Trizol方法及国际知名Q品牌同类产品的提取效果对比参见图1。
  
• 本试剂盒提取得到的RNA纯度高。本试剂盒提取得到的RNA的A260/A280通常为2.0-2.2。A260/A230通常为1.9-2.1。本试剂盒与传统的Trizol方法及国际知名Q品牌同类产品的提取效果对比参见图1。由图1可知，本试剂盒在提取组织样品的RNA时，A260/A230非常显著地高于Trizol法和Q品牌的同类产品，提示纯度高。
  
  图1．本试剂盒与Trizol、Q品牌同类产品的RNA提取效果对比。样品为冻存的50万个HeLa细胞、20mg小鼠肝组织和20mg小鼠脑组织。洗脱液用量均为40μL。均取6μL洗脱的样品经变性处理后，在含6.67%甲醛和适量NadRed的1.2%变性琼脂糖凝胶中电泳约45分钟后拍照。实际提取效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，本图仅供参考。
  注：纯的RNA其A260/A280约为2.0，但在很多仪器上测定时会高于2.0，低于1.9通常认为有蛋白、DNA或者酚等的污染；纯的RNA其A260/A230约为2.0左右或者略高，低于1.9通常认为有碳水化合物、胍盐、多肽或酚等的污染。

动物组织或细胞中的RNA按照长度可以分为长链RNA(long RNA)和小RNA(small RNA)，长链RNA通常大于200nt，而小RNA通常小于200nt。长链RNA按照是否编码蛋白或多肽可以分为长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)和mRNA。小RNA主要包括非编码的5.8S rRNA、5S rRNA、tRNA、microRNA(miRNA)、siRNA、piRNA、tsRNA、srRNA等。

组分	12T	50T	200T
裂解液	8mL	32mL	125mL
结合液	8mL	32mL	125mL
洗涤液I	8mL	32mL	125mL
洗涤液II	15mL	63mL	125mL×2
洗脱液	1.2mL	5mL	15mL
RNA纯化柱及废液收集管	12套	50套	200套
RNA洗脱管	12个	50个	200个

保存：室温，有效期1年。

• 对于富含RNase的样品(如动物组织)，建议使用前在裂解液中添加二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)至终浓度为40mM (例如1mL裂解液中加入20μL 2M DTT)或β-巯基乙醇至终浓度为1% (如1mL裂解液中加入10μL β-巯基乙醇)。含DTT或β-巯基乙醇的裂解液可在室温放置1个月。
  
• 通过本试剂盒抽提得到的RNA已经去除绝大多数DNA，通常情况无需DNase处理。后续如进行某些对DNA残留较敏感的实验时，可以在使用说明中步骤4离心后，在纯化柱中加入适量DNase I进行消化，具体请参考使用说明。
  
• 本试剂盒提供的所有试剂和耗材都是RNase-free，操作时应小心，避免被污染。所有自行准备的试剂和耗材也都应是RNase-free。如果可能有RNase污染，可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后高温高压灭菌并烘干。操作时应避免对着样品或所使用的试剂盒耗材呼气或说话，以防RNase污染。建议戴一次性口罩操作。
  
• 对于操作环境中RNA酶的去除，推荐使用百奥莱博的核酸酶喷雾清除剂(货号：YT400)以去除实验桌面上或其它接触面上的RNase。
  
• 使用冻存的细胞或组织抽提RNA的效果通常比新鲜的细胞或组织差一些。因为在细胞或组织冻融过程中一些细胞或组织内的RNase会被释放出来并剪切样品中的RNA。对于组织样品，推荐使用百奥莱博的动物组织RNA保存液(货号：YTB4010)进行保存以保证样品RNA的完整性。
  
• 本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
  
• 废液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丢弃。
  
• 结合液、洗涤液中含有乙醇，使用后须旋紧瓶盖以防挥发，并须按照易燃试剂的相关规范进行存放和使用。

本试剂盒提取RNA的基本流程如图2所示。样品在裂解液中迅速裂解，释放出总RNA，然后让RNA特异性地结合到纯化柱上，而基因组DNA和蛋白质等其它组分通过高速离心被有效去除，再通过3次洗涤充分去除非特异性结合的蛋白、盐等杂质，最后用洗脱液将高纯度的RNA洗脱下来。

图2．离心柱式RNA提取流程示意图

• 样品的准备：
  
  1. 细胞样品：收集50～100万左右的细胞。对于悬浮细胞，1000～2000×g离心1分钟后弃上清，加入300μL裂解液，轻轻吹打8～10次至固悬物溶解、溶液澄清；对于贴壁细胞，吸净培养液后加入300μL裂解液，轻轻吹打5～10次至固悬物溶解、溶液澄清，转移至一洁净离心管内。
     
  2. 组织样品：取15～20mg动物组织，置于液氮中研磨成粉末，立即加入600μL裂解液。也可将组织置于1.5mL离心管中，迅速加入600μL冰浴预冷的裂解液，用微型电动匀浆器匀浆，或者用普通玻璃匀浆器进行匀浆。研磨或匀浆后，轻轻吹打匀浆液8～10次，室温放置3～5分钟。然后约14000×g离心2分钟，将上清液移至新的离心管中。对于比较容易裂解且匀浆很充分的组织(如肝组织、脑组织等)可以不用高速离心而直接进入步骤2。
   
  注：细胞的数量一般不超过500万，不超过100万细胞宜使用300μL裂解液，多于100万细胞宜使用600μL裂解液。动物组织的用量一般不超过30mg，用量过多可能会因裂解不充分导致得率下降。组织样品在裂解和离心后，离心管下部可能会有一些胶状物质，宜作为上清转移至下一步操作。如果弃除胶状物，会导致得率下降约30～50%。后续加入结合液后胶状物会消失。离心是为了去除未匀浆充分的明显块状物。如果裂解后仍有粘稠物，需增加吹打次数至溶液完全澄清。对于富含RNase的样品，裂解液中宜添加DTT至终浓度为40mM或添加β-巯基乙醇至终浓度为1%。
• 加入等体积结合液至裂解液中，轻轻颠倒混匀3～5次。此时可能会有沉淀物产生，属于正常现象。
  
• 将混合物(包括沉淀物)转移至纯化柱内，12000×g离心30秒，倒弃收集管内液体。
  注：当裂解液的体积大于300μL时，在加入等体积结合液后，总体积会超过纯化柱的容量，这时应分成2次过柱，即将一半的混合物过柱后，再将剩余的混合物重复步骤3一次。对于一些特殊的样品，如出现溶液未完全通过时，可延长离心时间至1～2分钟，或者加大离心力至16000×g。对于一些能快速启动达到12000×g的离心机，离心30秒已经足够，对于一些启动速度缓慢的离心机本步骤及后续步骤中的30秒离心宜调整为60秒。
  
• 加入600μL洗涤液I，12000×g离心30秒，倒弃收集管内液体。
  选做：通过本试剂盒抽提得到的RNA已经去除绝大多数DNA，通常情况无需DNase处理。后续如进行某些对DNA残留较敏感的实验时，可在本步骤离心后，在纯化柱中加入80μL含10U DNase I的酶溶液(推荐使用百奥莱博RNase-free的DNase I，货号：YT411，每80μL酶溶液按照71.8μL水加8μL 10×Reaction Buffer再加0.2μL 50U/μL DNase I混合配制而成)，室温放置消化15分钟。消化结束后，不需要进行离心等任何额外的操作，直接进入步骤5。
  
• 加入600μL洗涤液II，12000×g离心30秒，倒弃收集管内液体。
  
• 重复步骤5一次。
  
• 最高速(约14000～16000×g)离心2分钟，去除残留的液体。
  
• 将RNA纯化柱置于本试剂盒提供的RNA洗脱管中，加入30～50μL洗脱液，室温放置2～3分钟，最高速离心30秒，所得溶液即为纯化的RNA。
  注意：洗脱液需要加到纯化柱柱面中央，使其被完全吸收。如需获得更高浓度的样品，可把洗脱液的体积减小至20μL，但洗脱下来的RNA量会相对减少。室温较低时，洗脱液在37℃预热片刻对得率有所帮助。此外，洗脱后的溶液再次加回到原纯化柱再离心洗脱一次，可提高得率约10～30%；或者在第一次洗脱后使用新的洗脱液再洗脱一次，会获得约为第一次洗脱量15～40%的RNA。

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